PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

ABSTRACT.- Cadore G.C., Marcon G., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2013. Mapping the sites of latency and reactivation by bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) and a thymidine kinase-deleted BoHV-5 in lambs. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(12):1409-1415. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com A thymidine kinase (tk)-deleted bovine herpesvirus 5 (BoHV-5tkΔ) was previously shown to establish latent infection and reactivate - even poorly - in a sheep model (Cadore et al. 2013). As TK-negative alphaherpesviruses are unlike to reactivate in neural tissue, this study investigated the sites of latency and reactivation by this recombinant in lambs. For this, groups of lambs were inoculated intranasally with the parental BoHV-5 strain (SV-507/99) or with the recombinant BoHV-5tkΔ. During latent infection (40 days post-inoculation, pi), the distribution of recombinant virus DNA in neural and non-neural tissues was similar to that of the parental virus. Parental and recombinant virus DNA was consistently detected by PCR in trigeminal ganglia (TGs); frequently in palatine and pharyngeal tonsils and, less frequently in the retropharyngeal lymph nodes. In addition, latent DNA of both viruses was detected in several areas of the brain. After dexamethasone (Dx) administration (day 40pi), the recombinant virus was barely detected in nasal secretions contrasting with marked shedding of the parental virus. In tissues of lambs euthanized at day 3 post-Dx treatment (pDx), reverse-transcription-PCR (RT-PCR) for a late viral mRNA (glycoprotein D gene) demonstrated reactivation of parental virus in neural (TGs) and lymphoid tissues (tonsils, lymph node). In contrast, recombinant virus mRNA was detected only in lymphoid tissues. These results demonstrate that BoHV-5 and the recombinant BoHV-5tkΔ do establish latent infection in neural and non-neural sites. Reactivation of the recombinant BoHV-5tkΔ, however, appeared to occur only in non-neural sites. In anyway, the ability of a tk-deleted strain to reactivate latent infection deserves attention in the context of vaccine safety.

• Bovine herpesvirus BoHV-5 thymidine kinase herpesvírus bovino BoHV-5 timidina quinase ovinos

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Cadore G.C., Marcon G., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2013. Mapping the sites of latency and reactivation by bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) and a thymidine kinase-deleted BoHV-5 in lambs. [Mapeamento dos sítios de latência e reativação pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) e por mutante deletado no gene da timidina quinase em ovinos.] Pesquisa Veterinária Brasileira 33(12):1409-1415. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Um recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 com deleção no gene da timidina quinase (BoHV-5tkΔ) foi capaz de estabelecer latência e reativar - embora ineficientemente - em modelo experimental em ovinos (Cadore et al. 2013). Como a reativação de alfaherpesvírus defectivos na TK em tecido neural é improvável, o presente estudo investigou os sítios de latência e reativação por esse recombinante em ovinos. Para isso, grupos de ovinos foram inoculados com a cepa de BoHV-5 parental (SV-507/99) ou com o recombinante BoHV-5tkΔ. Durante a infecção latente (dia 40 pós-infecção, pi) a distribuição do DNA do vírus recombinante no encéfalo de ovinos infectados experimentalmente foi similar ao do vírus parental (SV-507/99). O DNA de ambos os vírus foi detectado consistentemente por PCR nos gânglios trigêmeos (TGs), frequentemente nas tonsilas faríngeas e palatinas e, com menos frequência, nos linfonodos retrofaríngeos. Após administração de dexametasona (Dx), o vírus recombinante foi raramente detectado nas secreções nasais, contrastando com excreção abundante do vírus parental. RT-PCR para mRNA de um gene tardio (glicoproteína D) realizado em tecidos de animais eutanasiados 3 dias pós-Dx demonstrou reativação do vírus parental em tecido neural (TGs) e não-neural (tonsilas, linfonodo). Em contraste, a reativação do vírus recombinante ficou restrita ao tecido linfoide. Esses resultados demonstram que tanto o BoHV-5 parental quanto o recombinante estabelecem latência em sítios neurais e não-neurais. No entanto, o recombinante BoHV-5tkΔ parece reativar apenas nos tecidos não-neurais (linfoide). De qualquer forma, a capacidade do recombinante reativar a infecção latente deve ser considerada no contexto de segurança vacinal.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Cadore G.C., Weiss M., Anziliero D., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2013. A thymidine kinase-deleted bovine herpesvirus 5 establishes latent infection but reactivates poorly in a sheep model. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(3):331-338. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com The ability of thymidine kinase (tk)-deleted recombinant bovine herpesvirus 5 (BoHV-5tkD) to establish and reactivate latent infection was investigated in lambs. During acute infection, the recombinant virus replicated moderately in the nasal mucosa, yet to lower titers than the parental strain. At day 40 post-infection (pi), latent viral DNA was detected in trigeminal ganglia (TG) of all lambs in both groups. However, the amount of recombinant viral DNA in TGs was lower (9.7-fold less) than that of the parental virus as determined by quantitative real time PCR. Thus, tk deletion had no apparent effect on the frequency of latent infection but reduced colonization of TG. Upon dexamethasone (Dx) administration at day 40 pi, lambs inoculated with parental virus shed infectious virus in nasal secretions, contrasting with lack of infectivity in secretions of lambs inoculated with the recombinant virus. Nevertheless, some nasal swabs from the recombinant virus group were positive for viral DNA by PCR, indicating low levels of reactivation. Thus, BoHV-5 TK activity is not required for establishment of latency, but seems critical for efficient virus reactivation upon Dx treatment.

• BoHV-5

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Cadore G.C., Weiss M., Anziliero D., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2013. A thymidine kinase-deleted bovine herpesvirus 5 establishes latent infection but reactivates poorly in a sheep model. [Recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 com deleção na timidina quinase estabelece infecção latente porém reativa ineficientemente em ovinos.] Pesquisa Veterinária Brasileira 33(3):331-338. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com A capacidade de um recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 com deleção no gene da timidina quinase (BoHV-5tk∆) em estabelecer e reativar infecção latente foi investigada em cordeiros. Durante a infecção aguda, o vírus recombinante replicou na mucosa nasal em títulos moderados, porém menores do que os da cepa parental. Aos 40 dias pós-infecção (pi) DNA viral latente foi detectado no gânglio trigêmeo (TG) de todos os cordeiros em ambos os grupos. No entanto, a quantidade de DNA do vírus recombinante nos TGs foi 9,7 vezes menor do que do vírus parental, segundo determinação por PCR em tempo real. Assim, a deleção do gene tk (timidina quinase) não produziu efeito aparente sobre a frequência da infecção latente, porém reduziu a colonização do TG. Após a administração de dexametasona (Dx) no dia 40pi, os cordeiros inoculados com o vírus parental excretaram partículas virais infecciosas, contrastando com a falta de infectividade nas secreções nasais dos animais inoculados com o vírus recombinante. Entretanto, alguns suabes nasais dos cordeiros do grupo do vírus recombinante foram positivos para o DNA viral por PCR, indicando baixos níveis de reativação. Assim, a atividade da enzima timidina quinase não é requerida para o estabelecimento de latência pelo BoHV-5, mas parece fundamental para reativação eficiente da infecção latente após tratamento com Dx.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Silva S.C., Brum M.C.S., Oliveira S.A.M., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. A thymidine kinase-negative bovine herpesvirus 5 is highly attenuated for rabbits, but is neuroinvasive and establishes latent infection. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(5):389-397. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Mutant viral strains deleted in non-essential genes represent useful tools to study the function of specific gene products in the biology of the virus. We herein describe an investigation on the phenotype of a bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) recombinant deleted in the gene encoding the enzyme thymidine kinase (TK) in rabbits, with special emphasis to neuroinvasiveness and the ability to establish and reactivate latent infection. Rabbits inoculated with the parental virus (SV-507/99) (n=18) at a low titer (105.5TCID50) shed virus in nasal secretions in titers up to 104.5TCID50 for up to 12 days (average: 9.8 days [5-12]) and 5/16 developed neurological disease and were euthanized in extremis. Rabbits inoculated with the recombinant BoHV-5TKD at a high dose (107.1TCID50) also shed virus in nasal secretions, yet to lower titers (maximum: 102.3TCID50) and for a shorter period (average: 6.6 days [2-11]) and remained healthy. PCR examination of brain sections of inoculated rabbits at day 6 post-infection (pi) revealed a widespread distribution of the parental virus, whereas DNA of the recombinant BoHV-5TKD-was detected only in the trigeminal ganglia [TG] and olfactory bulbs [OB]. Nevertheless, during latent infection (52pi), DNA of the recombinant virus was detected in the TGs, OBs and also in other areas of the brain, demonstrating the ability of the virus to invade the brain. Dexamethasone (Dx) administration at day 65 pi was followed by virus reactivation and shedding by 5/8 rabbits inoculated with the parental strain (mean duration of 4.2 days [1 – 9]) and by none of seven rabbits inoculated with the recombinant virus. Again, PCR examination at day 30 post-Dx treatment revealed the presence of latent DNA in the TGs, OBs and in other areas of the brain of both groups. Taken together, these results confirm that the recombinant BoHV-5TKD is highly attenuated for rabbits. It shows a reduced ability to replicate in the nose but retains the ability to invade the brain and to establish latent infection. Additional studies are underway to determine the biological and molecular mechanisms underlying the inability of BoHV-5TKD to reactivate from latency.

• BoHV-5 neuroinvasiveness thymidine kinase-bovine herpesvirus 5 neuroinvasividade herpesvírus bovino tipo 5 timidina quinase

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Silva S.C., Brum M.C.S., Oliveira S.A.M., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. A thymidine kinase-negative bovine herpesvirus 5 is highly attenuated for rabbits, but is neuroinvasive and establishes latent infection. [Cepa do herpesvírus bovino tipo 5 defectiva na timidina quinase é altamente atenuada para coelhos mas é neuroinvasiva e estabelece infecção latente.] Pesquisa Veterinária Brasileira 31(5):389-397. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Cepas virais mutantes defectivas em genes não essenciais se constituem em ferramentas úteis para o estudo da função de proteínas virais na biologia dos vírus. Este estudo relata uma investigação do fenótipo, em coelhos, de uma cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) defectiva na enzima timidina quinase (TK), com ênfase para a neuroinvasividade e capacidade de estabelecer e reativar a infecção latente. Coelhos inoculados com o vírus parental (SV-507/99, n=18) em baixo título (105,5TCID50) excretaram o vírus nas secreções nasais em títulos de até 104,5TCID50/mL por até 12 dias (média: 9,8 dias [5-12]) e 5/16 desenvolveram doença neurológica e morreram ou foram eutanasiados in extremis. Em contraste, coelhos inoculados com o recombinante BoHV-5TKD em alto título (107,1TCID50) excretaram o vírus em títulos inferiores (máximo 102,3TCID50/mL), por um período menor (média: 6,6 days [2-11]) e permaneceram saudáveis. A realização de PCR em seções do encéfalo no dia 6 pós-infecção (pi) revelou uma ampla distribuição do DNA do vírus parental, enquanto o DNA do vírus recombinante foi detectado apenas nos gânglios trigêmeos [TGs] e nos bulbos olfatórios [OBs]. Não obstante, durante a infecção latente (52pi), o DNA do vírus recombinante foi detectado nos TGs, OBs e em outros locais do encéfalo, demonstrando que o vírus recombinante mantém a neuroinvasividade. Tratamento com dexamethasona (Dx) no dia 65 pi resultou em reativação e excreção viral por 5/8 dos coelhos inoculados com o vírus parental (duração média de 4,2 dias [1-9]) e por nenhum dos sete coelhos inoculados com o vírus recombinante. No entanto, PCR realizado no dia 30 pós-Dx revelou a presença de DNA latente do BoHV-5TKD nos TGs, OBs e em outras áreas do encéfalo. Esses resultados confirmam que o recombinante BoHV-5TKD é altamente atenuado para coelhos. A sua capacidade de replicação na mucosa nasal é reduzida, mas mantém a capacidade de invadir o encéfalo e estabelecer infecção latente. Estudos adicionais estão em andamento para elucidar os mecanismos responsáveis pela incapacidade do recombinante de reativar a infecção latente.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Santos C.M.B., Anziliero D., Bauermann F.V., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. Experimental infection of calves with recombinants of bovine herpesvirus 5 defective in glycoprotein E (gE), thymidine kinase (TK) and both, gE/TK. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(4):319-325. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com This article describes an investigation on the virulence/attenuation of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) recombinants deleted in the genes encoding glycoprotein E (BoHV-5gED), thymidine kinase (BoHV-5TKD), and both gE and TK (BoHV-5gEDTKD). Seronegative calves (80 to 90 days-old) inoculated with the parental strain (SV-507/99, n=5) shed virus in nasal secretions for up to 15 days (average 10.8 days). Duration of virus shedding was 11 days for BoHV-5gD, 9.6 days for BoHV-5TKD and 6.2 days for BoHV-5gEDTKD groups. The highest titers were observed between days 1 and 6 post-infection (pi) for SV-507/99 (106.8TCID50/mL), 105.1TCID50/mL (BoHV-5gED), 105.9TCID50/mL (BoHV-5TKD) and 104.7TCID50/mL (BoHV-5gEDTKD). Calves inoculated with the parental virus presented anorexia, profound apathy and loss of body condition. Two calves were euthanized in extremis on days 10 and 11 pi; infectious virus was recovered from several areas of the brain. In contrast, calves inoculated with the recombinants remained healthy and a few presented a mild and transient nasal secretion. Dexamethasone (Dx) administration at day 42 pi resulted in virus shedding by all controls calves (mean duration 3.7 days), by 2/5 of BoHV-5TKD calves (two days) and 2/5 of BoHV-5gED (one day). No virus shedding was detected in BoHV-5gEDTKD calves upon Dx treatment. PCR examination of brain sections of calves euthanized at day 30 post Dx treatment revealed the presence of latent viral DNA widely distributed in the brain of SV-507/99 calves. Latent viral DNA was detected in a few sections (3/30) of the brains of BoHV-5gED calves and was not detected in the brains of calves inoculated with BoHV-5TKD and BoHV-5gEDTKD. These results show that the single BoHV-5 mutants (gE and tk-deleted) are attenuated for calves and establish and/or reactivate latent infection inefficiently. The double mutant BoHV-5gEDTKD is fully attenuated and appears not to establish or not reactivate efficiently from latent infection. Thus, these recombinants, especially the double mutant BoHV-5gEDTKD, display an adequate phenotype for use in modified-live vaccine formulations.

• Bovine herpesvirus 5 glycoprotein E thymidine kinase BoHV-5 herpesvírus bovino tipo 5 glicoproteína E timidina quinase

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Santos C.M.B., Anziliero D., Bauermann F.V., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. Experimental infection of calves with recombinants of bovine herpesvirus 5 defective in glycoprotein E (gE), thymidine kinase (TK) and both, gE/TK. [Infecção experimental de bezerros com recombinantes do herpesvírus bovino tipo 5 defectivos na glicoproteína E (gE), timidina quinase (TK) e ambos, gE/TK.] Pesquisa Veterinária Brasileira 31(4):319-325. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Este artigo descreve uma investigação da virulência/atenuação de recombinantes do herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) com deleções nos genes da glicoproteína E (BoHV-5gED), timidina quinase (BoHV-5TKD), e ambos gE e TK (BoHV-5gEDTKD). Bezerros soronegativos (80-90 dias de idade) inoculados com o vírus parental SV-507/99 (n=5) excretaram o vírus em secreções nasais por até 15 dias (média de 10,8 dias). Nos animais inoculados com os recombinantes, a duração da excreção viral foi de 11 dias (BoHV-5gED), 9,6 dias (BoHV-5TKD) e 6,2 dias (BoHV-5gEDTKD). Os maiores títulos foram observados entre os dias 1 e 6 pós-inoculação (pi), sendo de 106,8TCID50/mL para o SV-507/99, 105,1TCID50/mL (BoHV-5gED), 105,9TCID50/mL (BoHV-5TKD) e 104,7TCID50/mL (BoHV-5gEDTKD). Os bezerros inoculados com o vírus parental apresentaram anorexia e apatia; três deles mostraram apatia profunda e perda da condição corporal. Dois bezerros foram eutanasiados in extremis nos dias 10 e 11 pi, respectivamente e o vírus foi isolado de várias regiões do encéfalo. Já os bezerros inoculados com os recombinantes permaneceram saudáveis; alguns apresentaram uma secreção nasal serosa transitória. Administração de dexametasona (Dx) no dia 42 pi resultou em excreção viral por todos os bezerros inoculados com o vírus parental (duração média de 3,7 dias), por 2 de 5 bezerros dos grupos BoHV-5TKD (dois dias) e BoHV-5gED (um dia). Os bezerros inoculados com o duplo mutante BoHV-5gEDTKD não excretaram o vírus após o tratamento com Dx. Pesquisa de DNA viral por PCR no dia 30 pós-Dx revelou uma ampla distribuição do DNA do vírus parental no encéfalo; poucas seções (3/30) foram positivas no encéfalo dos animais do grupo BoHV-5gED, e não detectou-se DNA latente no encéfalo dos animais dos grupos BoHV-5TKD e BoHV-5gEDTKD. Esses resultados demonstram que os mutantes simples (gE and tk-deletados) são atenuados para bezerros e estabelecem e/ou reativam infecção latente ineficientemente. Já o duplo mutante BoHV-5gEDTKD é atenuado e parece não estabelecer e/ou não reativar eficientemente a infecção latente. Portanto, os vírus recombinantes, e em especial o duplo mutante BoHV-5gEDTKD apresentam um fenótipo compatível com a sua inclusão em vacinas vivas modificadas.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Anziliero D., Santos C.M.B., Bauermann F.V., Cardozo L., Bernardes L.M., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. [A recombinant bovine herpesvirus 5 defective in thymidine kinase and glycoprotein E is attenuated and immunogenic for calves.] Cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 defectiva na timidina quinase e glicoproteína E é atenuada e imunogênica para bezerros. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(1):23-30. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) is an important pathogen of cattle in South America and efforts have been made to produce safer and more effective vaccines. In addition to afford protection, herpesvirus vaccines should allow serological differentiation of vaccinated from naturally, latently infected animals. We previously reported the construction and characterization in vitro of a double mutant BoHV-5 (BoHV-5gE/TK”D) lacking the genes encoding thymidine kinase (tk) for attenuation, and glycoprotein E (gE) as the antigenic marker, as a vaccine candidate strain (Brum et al. 2010a). The present article reports an investigation on the attenuation and immunogenicity of this recombinant in calves. In a first experiment, 80 to 90-day-old seronegative calves (n=6) inoculated intranasally with the recombinant (titer of 107.5TCID50) shed virus in low to moderate titers in nasal secretions for up to 6 days, yet did not develop any respiratory, systemic or neurological signs of infection. At day 30 post-infection (pi) all calves had BoHV-5 specific neutralizing (VN) antibodies in titers of 4 to 8 and were negative for anti-gE antibodies in a commercial ELISA test. Administration of dexamethasone (0.1mg/kg/day during 5 days) to four of these calves at day 42 pi did not result in virus shedding or increase in VN titers, indicating lack of viral reactivation. Secondly, a group of 8-month-old calves (n=9) vaccinated intramuscularly (IM) with the recombinant virus (107.5TCID50/animal) did not shed virus in nasal secretions, remained healthy and developed VN titers from 2 to 8 at day 42 post-vaccination (pv), remaining negative for gE antibodies. Lastly, 21 calves (around 10 months old) maintained under field conditions were vaccinated IM with the recombinant virus (titer of 107.3TCID50). All vaccinated animals developed VN titers from 2 to 16 at day 30 pv. A boost vaccination performed at day 240 pv resulted in a rapid and strong anamnestic antibody response, with VN titers reaching from 16 to 256 at day 14 post-booster. Again, serum samples remained negative for gE antibodies. Selected serum samples from vaccinated animals showed a broad VN activity against nine BoHV-5 and eight BoHV-1 field isolates. These results show that the recombinant virus is attenuated, immunogenic for calves and induces an antibody response differentiable from that induced by natural infection. Thus, the recombinant BoHV-5gE/TKD is an adequate candidate strain for a modified live vaccine.

• Bovine herpesvirus 5 vaccine herpesvírus bovino 5 vacina

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Anziliero D., Santos C.M.B., Bauermann F.V., Cardozo L., Bernardes L.M., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. [A recombinant bovine herpesvirus 5 defective in thymidine kinase and glycoprotein E is attenuated and immunogenic for calves.] Cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 defectiva na timidina quinase e glicoproteína E é atenuada e imunogênica para bezerros. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(1):23-30. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um importante patógeno de bovinos na América do Sul e tem suscitado esforços para o desenvolvimento de vacinas mais seguras e eficazes. Além de conferirem proteção, vacinas contra os herpesvírus animais devem permitir a diferenciação sorológica entre animais vacinados e infectados naturalmente. Foi recentemente relatada a construção e caracterização in vitro de um recombinante do BoHV-5 defectivo na enzima timidina quinase (tk) para atenuação e, na glicoproteína E (gE) como marcador antigênico, como potencial cepa vacinal (Brum et al. 2010a). O presente artigo relata uma investigação sobre da atenuação e imunogenicidade do recombinante BoHV-5gE/TKD em bezerros. Em um primeiro experimento, bezerros soronegativos, com 80 a 90 dias de idade (n=6), inoculados pela via intranasal (IN) com o vírus recombinante (título de 107,5TCID50) excretaram baixos títulos de vírus nas secreções nasais por até seis dias, mas não desenvolveram sinais sistêmicos, respiratórios ou neurológicos. No dia 30 pós-infecção (pi), todos os animais possuíam anticorpos neutralizantes contra o BoHV-5, em títulos entre 4 e 8, mas permaneceram negativos para anticorpos contra a gE. Administração de dexametasona (Dx) a quatro desses bezerros no dia 42 pi (0.1mg/kg/dia durante 5 dias) não resultou em excreção viral ou em aumento dos títulos de anticorpos, indicando ausência de reativação viral. Em um segundo experimento, vacinação intramuscular (IM) de bezerros com 8 meses de idade (n=9) com o recombinante (107,5TCID50/animal) não resultou em excreção viral ou em manifestações clínicas. Os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 8 no dia 42 pós-vacinação (PV) e permaneceram negativos para anticorpos anti-gE. Finalmente, 21 bezerros (aproximadamente 10 meses de idade) mantidos a campo foram vacinados com o recombinante (107,3TCID50) pela via IM. Todos os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 16 no dia 30pv. Revacinação desses animais no dia 240 pv provocou uma resposta anamnéstica rápida e intensa, resultando em títulos neutralizantes entre 16 e 256 no dia 14 pós-revacinação. O soro de todos os animais permaneceu negativos para anticorpos contra a gE. Amostras de soro dos animais vacinados apresentaram atividade neutralizante cruzada frente a nove isolados de BoHV-5 e oito de BoHV-1. Esses resultados demonstram que o recombinante é atenuado e imunogênico para bezerros e induz uma resposta sorológica diferenciável da resposta à infecção natural. Portanto, o recombinante se constitui em um potencial candidato a cepa vacinal.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Brum M.C.S., Caron L., Chowdhury S.I., Weiblen R. & Flores E.F. 2010. Immunogenicity of an inactivated bovine herpesvirus type 5 strain defective in thymidine kinase and glycoprotein E. Pesquisa Veterinária Brasileira 30(1):57-62. Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria, Av. Roraima 1000, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com The immunogenicity of an inactivated, experimental vaccine based on a bovine herpesvirus type 5 strain defective in thymidine kinase and glycoprotein E (BoHV-5 gE/TKD) was evaluated in cattle and the results were compared with a vaccine containing the parental BoHV-5 strain (SV507/99). To formulate the vaccines, each virus (wildtype SV507/99 and BoHV-5 gE/TKD) was multiplied in cell culture and inactivated with binary ethyleneimine (BEI). Each vaccine dose contained approximately of 107.5 TCID50 of inactivated virus mixed with an oil-based adjuvant (46:54). Forty calves, 6 to 9-months-old, were allocated into two groups of 20 animals each and vaccinated twice (days 0 and 22pv) by the subcutaneous route with either vaccine. Serum samples collected at day 0 and at different intervals after vaccination were tested for virus neutralizing (VN) antibodies against the parental virus and against heterologous BoHV-5 and BoHV-1 isolates. The VN assays demonstrated seroconversion to the respective homologous viruses in all vaccinated animals after the second vaccine dose (mean titers of 17.5 for the wildtype vaccine; 24.1 for the recombinant virus). All animals remained reagents up to day 116 pv, yet showing a gradual reduction in VN titers. Animals from both vaccine groups reacted in similar VN titers to different BoHV-1 and BoHV-5 isolates, yet the magnitude of serological response of both groups was higher against BoHV-5 field isolates. Calves vaccinated with the recombinant virus did not develop antibodies to gE as verified by negative results in a gE-specific ELISA, what would allow serological differentiation from naturally infected animals. Taken together, these results indicate that inactivated antigens of BoHV-5 gE/TK recombinant virus induced an adequate serological response against BoHV-5 and BoHV-1 and thus can be used as an alternative, differential vaccine candidate.

• Herpesvirus type 5 thymidine kinase glycoprotein E

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Brum M.C.S., Caron L., Chowdhury S.I., Weiblen R. & Flores E.F. 2010. Immunogenicity of an inactivated bovine herpesvirus type 5 strain defective in thymidine kinase and glycoprotein E. [Imunogenicidade de uma cepa inativada do herpesvírus bovino tipo 5 defectiva na timidina quinase e glicoproteína E.] Pesquisa Veterinária Brasileira 30(1):57-62. Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria, Av. Roraima 1000, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com A imunogenicidade de vacina experimental inativada, produzida com uma cepa do herpesvírus bovino tipo 5 defectiva nos genes da timidina quinase e glicoproteína E (BoHV-5 gE/TKD) foi avaliada em bovinos e o resultado foi comparado com a resposta induzida pela cepa parental do BoHV-5 (SV507/99). Para a formulação da vacina, cultivos de células infectados com cada um dos vírus (SV507/99 ou BoHV-5 gE/TKD) foram inativados com etilenamina binária. Cada dose de vacina continha aproximadamente 107,5 TCID50 de um dos vírus inativados emulsionado em adjuvante oleoso (46:54). Quarenta bezerros de raças cruzadas, com idade entre seis a nove meses, foram alocados em dois grupos de 20 animais cada e vacinados duas vezes (dia 0 e 22 pv) pela via subcutânea com uma das vacinas. Amostras de soro foram coletadas no dia 0 e a vários intervalos após vacinação para a pesquisa de anticorpos neutralizantes frente ao vírus homólogo ou frente a isolados de BoHV-5 e BoHV-1. Os testes de soroneutralização (SN) demonstraram que todos os animais soroconverteram após a segunda dose da vacina (títulos médios de 17,5 para o grupo SV507/99; 24,1 para o grupo BoHV-5 gE/TKD). Todos os animais mantiveram níveis de anticorpos neutralizantes até o dia 116 pv, no entanto foi observada uma redução gradual no títulos. A sorologia cruzada com amostras heterólogas do BoHV-5 e BoHV-1 indicou que ambos os grupos vacinais reagiram em níveis similares frente ao mesmo vírus, no entanto a magnitude da resposta sorológica foi maior frente a amostras de BoHV-5. Os animais vacinados com a cepa recombinante não desenvolveram anticorpos contra a gE detectáveis por um ELISA específico, o que permitiria a sua diferenciação sorológica de animais infectados naturalmente. Esses resultados demonstram que a vacina contendo antígenos inativados do vírus recombinante BoHV-5 gE/TKD induziu resposta sorológica em níveis satisfatórios, constituindo-se, assim, em alternativa a cepa vacinal diferencial.